Коллектив авторов
Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге
Методы исследования мочевой кислоты сыворотки крови
Мочевая кислота является продуктом распада пуриновых нуклеотидов, входящих в состав нуклеиновых кислот, макроэргических соединений, некоторых коферментов. Из эндогенных нуклеотидов в организме человека образуется около 500 мг мочевой кислоты, из поступающих с пищей – примерно 200 мг. Большая часть мочевой кислоты, образовавшейся в тканях, выделяется с мочой (до 75%), остальная часть экскретируется с калом. Величина экскреции мочевой кислоты с мочой зависит от присутствия пуринов в пище: при обычной диете с мочой ежедневно выделяется до 0,7 г мочевой кислоты, при богатой пуринами диете – до 1 г. В клинико-диагностических лабораториях для определения мочевой кислоты используют колориметрический и ферментативный методы.
Нормальные величины:
1) мужчины до 60 лет – 0,1–0,40 ммоль/л (4,0–8,5 мг/дл); мужчины старше 60 лет – 0,25–0,47 ммоль/л;
2) женщины до 60 лет – 0,24–0,50 ммоль/л (2,8–7,5 мг/дл); женщины старше 60 лет – 0,19–0,43 ммоль/л.
Принцип метода
Мочевая кислота восстанавливает фосфорно-вольфрамовый реактив с образованием соединения голубого цвета.
Необходимые реактивы
1. Серная кислота, 0,35 моль/л: к 200 мл воды добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты относительной плотности 1,84 и доводят объем водой до 500 мл.
2. Натрий вольфрамовокислый двухводный (Na2WO4 × 2H2O), 100 г/л: растворяют 50 г вольфрамовокислого натрия в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.
3. Натрия карбонат, 103 г/л: растворяют 51,5 г натрия карбоната в небольшом количестве воды и доводят объем до 500 мл.
4. Ортофосфорная кислота 85%-ная.
5. Лития сульфат.
6. Лития карбонат.
7. Фосфорно-вольфрамовый реактив; в круглодонную колбу вместимостью 1,5 л вносят 40 г вольфрамовокислого натрия и 300 мл воды. Добавляют 32 мл 85%-ной ортофосфорной кислоты и несколько стеклянных бусинок. Осторожно кипятят в течение 2 ч на песочной или глицериновой бане с обратным холодильником.
Охлаждают до комнатной температуры и доливают водой до 1 л. Добавляют 32 г сульфата лития. Раствор стабилен при хранении в холодильнике.
8. Мочевая кислота.
9. Формалин, не ниже 37,5%-ной концентрации.
10. Основной калибровочный раствор мочевой кислоты, 6 ммоль/л: растворяют 0,6 г карбоната лития в 150 мл воды, фильтруют и нагревают до 60 °С. Взвешивают 1,017 г мочевой кислоты, вносят в предварительно нагретую колбу вместимостью 1 л, вливают теплый раствор карбоната лития и быстро встряхивают. После растворения мочевой кислоты колбу охлаждают до комнатной температуры, добавляют 20 мл раствора формалина, наливают 300–350 мл воды. Добавляют несколько капель раствора метилового оранжевого, затем встряхивают, медленно добавляют 20–22 мл 0,35 моль/л серной кислоты до изменения цвета в розовый. Доливают колбу до метки водой. Раствор стабилен при хранении в холодильнике в посуде из темного стекла; 1 мл раствора содержит 0,006 ммоль мочевой кислоты.
11. Рабочий калибровочный раствор мочевой кислоты, 0,03 ммоль/л: 1 мл основного калибровочного раствора доводят до 200 мл водой. Стабилен в течение 2 недель при хранении в холодильнике.
Ход определения
Опытная проба: к 8 мл воды добавляют 1 мл сыворотки, 0,5 мл 0,35 моль/л серной кислоты и перемешивают. Затем добавляют 0,5 мл раствора вольфрамовокислого натрия и тщательно перемешивают. Через 5–10 мин фильтруют. К 3 мл фильтрата добавляют 1,5 мл раствора натрия карбоната, перемешивают. Затем добавляют 1 мл фосфорно-вольфрамового реактива, перемешивают, переворачивая пробирку. Через 30 мин измеряют в кювете с толщиной слоя в 1 см при длине волны 590–700 нм (красный светофильтр) против холостой пробы. Холостую пробу ставят так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл воды.
Расчет ведут по формуле при сравнении с калибровочной пробой. Калибровочную пробу ставят и измеряют так же, как опытную, но вместо фильтрата берут 3 мл рабочего калибровочного раствора.
Концентрация мочевой кислоты, ммоль/л:
Еоп/ Ек× Ск× 10,
где Еоп – экстинкция опытной пробы;
Ек – экстинкция калибровочной пробы;
Ск – концентрация рабочего калибровочного раствора, 0,03 ммоль/л;
10 – пересчет на объем сыворотки (в опытную пробу берут 0,3 мл, т. е. в 10 раз меньше, чем в калибровочную пробу).
Клинико-диагностическое значение
Исследование содержания мочевой кислоты в сыворотке крови имеет значение для диагностики начальных стадий поражения почек и подагры.
Считают, что при поражении клубочков почки (острый и хронический нефрит, первично- и вторично-сморщенная почка) в первую очередь страдает выделение мочевой кислоты и индикана, вследствие чего наблюдается гиперурикемия. При очаговых нефритах и нефрозах выделение мочевой кислоты не нарушается.
При подагре наблюдается нарушение обмена нуклеопротеидов, вызывающее отложение солей мочевой кислоты в суставах и различных тканях тела.
Много мочевой кислоты определяется в крови и моче при патологических состояниях, связанных с усиленным распадом нуклеопротеидов: лейкозах, лейкемии, после облучения рентгеновскими лучами, лейкопении, полицитемии, эритремии, гемолитической желтухе, злокачественной анемии в стадии ремиссии, злокачественных новообразованиях, а также при сердечной и печеночной недостаточности, диабете, голодании, усиленном потреблении жирной пищи, аллергии, гипертрофии предстательной железы, илеусе, артрите, ацидозе, пневмонии в стадии резорбции, отравлении свинцом и угарным газом.
Снижение содержания кислоты в сыворотке крови отмечается при анемии, после приема пиперазина, атофана, салицилатов и АКТГ.
Методы исследования пигментного обмена
В основе образования билирубина лежит деградация гема гемоглобина и других гемсодержащих белков и ферментов. Гем распадается до биливердина, который восстанавливается в билирубин.
Свободный билирубин токсичен, не растворяются в воде и циркулирует в крови в комплексе с альбуминами. Этот билирубин дает непрямую реакцию Ван ден Берга (после осаждения альбуминов спиртом), поэтому называется непрямым.
Непрямой билирубин, будучи связанным с альбуминами, не проходит через неповрежденные мембраны почечных клубочков и не фильтруется в мочу.
Выведение билирубина осуществляется с желчью через кишечник. Билирубин, связанный с альбуминами, доставляется кровью в печень. Билирубин легко проникает через мембраны гепатоцитов, альбумины остаются в кровотоке.
В гепатоцитах билирубин подвергается конъюгации с глюкуроновой кислотой, превращаясь в билирубинмоно- и диглюкуронид.
Образованные билирубинглюкурониды нетоксичны, легко растворимы. Они направляются с желчью в кишечник для выведения из организма.
Из кишечника билирубинглюкурониды частично поступают в кровоток и, находясь в крови, представляют собой фракцию прямого билирубин, который дает прямую реакцию Ван ден Берга. Прямой билирубин в отличие от непрямого легко проникает через почечные фильтры и может выделяться с мочой.
В физиологических условиях сыворотка крови содержит примерно 25% прямого билирубина (связанного с глюкуроновой кислотой) и 75% непрямого билирубина (альбумин-билирубина).
Таким образом, общий билирубин крови представляет собой суммарное количество непрямого и прямого билирубина.
У здоровых людей в сыворотке крови содержится: общего билирубина 3,4–20,5 мкмоль/л; прямого (конъюгированного) – 0,86–5,3 мкмоль/л; непрямого (свободного) – 1,7–17,1 мкмоль/л.
Для определения билирубина используется колориметрический метод, основу которого составляет реакция Ван ден Берга. Реакция протекает в 2 стадии: на первой под воздействием соляной кислоты разрывается тетрапирроловая цепь, в результате чего образуются два дипиррола, на второй – оба дипирроловых производных диазотируются диазофенилсульфоновой кислотой с превращением их в азобилирубин. Фракционное содержание билирубина определяется с помощью модифицированного метода Ван ден Берга, предложенного Ендрассиком. Метод принят в качестве унифицированного.
Принцип метода Ван ден Берга
Билирубин вступает в реакцию азосочетания с диазотированной сульфаниловой кислотой с образованием раствора азокрасителя. Интенсивность окраски пропорциональна содержанию билирубина и выявляется фотометрически.
Оригинальным методом Ван ден Берга устанавливается лишь характер реакции (прямая, непрямая, замедленная), т. е. отмечается преобладание в сыворотке крови того или иного билирубина. Метод Ендрассика, Клеггорна и Грофа дает возможность фракционно определять содержание билирубина. Он прост, удобен в практике, не связан с применением дефицитных реактивов и является наиболее приемлемым для практических лабораторий.
Определение рекомендуется проводить сразу же после забора проб, чтобы избежать окисления билирубина на свету. Гемолиз сыворотки снижает количество билирубина пропорционально присутствию гемоглобина. Следовательно, сыворотка крови не должна быть гемолизирована.
Унифицированный метод по диазореакции в присутствии акселератора (метод Ендрассика—Клеггорна—Грофа)
Принцип метода
Под воздействием НСl разрывается тетрапирроловая связь билирубина, в результате чего образуются два дипиррола, которые диазотируются диазобензосульфоновой кислотой с образованием розово-фиолетового азобилирубина. Связанный билирубин реагирует быстро, несвязанный билирубин реагирует после добавления кофеинового реактива.
Необходимые реактивы
1. Кофеин.
2. Натрия бензоат.
3. Натрия ацетат 3-водный.
4. Кофеиновый реактив: 5 г кофеина, 7,5 г бензоата натрия, 12,5 г ацетата натрия растворяют в 90 мл воды, нагревают до температуры 50–60 °С, хорошо перемешивают. После охлаждения доливают водой до 100 мл. Раствор стабилен в течение 2 недель.
5. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 0,9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают до метки водой.
6. НСl концентрированная.
7. Сульфаниловая кислота.
8. Диазосмесь. Диазореактив I: 5 г сульфаниловой кислоты растворяют при нагревании в 300–400 мл воды, прибавляют 15 мл концентрированной НСl. Если сульфаниловая кислота полностью не растворяется, колбу помещают в теплую воду и помешивают. Только после растворения и охлаждения раствор доливают водой до 1 л. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла. Диазореактив II – натрия нитрит, 5 г/л (0,07 моль/л): 0,5 г нитрита натрия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доливают водой до метки. Реактив стабилен в течение 2–3 недель при хранении в посуде из темного стекла. Перед работой смешивают 10 мл диазореактива I и 0,3 мл диазореактива II.
9. Билирубин для построения калибровочного графика, 800 мг/л, или 1368 мкмоль/л. Коммерческие препараты кристаллического билирубина содержат разные примеси, которые могут мешать реакции азосочетания. Рекомендуется использовать набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон», содержащий билирубин высокой степени чистоты с коэффициентом молярной экстинкции не менее 6,05 × 104 л при 453 нм и растворении в хлороформе. Растворы билирубина нестойкие, поэтому их готовят с добавлением белка в качестве стабилизатора. Коммерческие препараты билирубина не связаны с глюкуроновой кислотой.
10. Натрия карбонат, 0,1 моль/л: 10,6 г безводного NаСО3 растворяют и доливают до 1 л водой.
11. Уксусная кислота, 4 моль/л: 25 мл ледяной уксусной кислоты доливают до 100 мл водой.
Ход определения
В 3 пробирки (2 опытные пробы и холостая) вводят реактивы, как указано в таблице 10.
Таблица 10
Диазореакция
Для определения связанного билирубина измерение проводят спустя 5–10 мин после добавления диазосмеси, так как при длительном стоянии в реакцию вступает несвязанный билирубин. Для определения общего билирубина пробу для развития окраски оставляют стоять 20 мин, после чего измеряют на фотометре. При дальнейшем стоянии окраска не изменяется.
Измерение проводят при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя в 0,5 см против воды. Из показателей, полученных при измерении общего и связанного билирубина, вычитают показатель холостой пробы.
Расчет производят по калибровочному графику. Находят содержание общего и связанного билирубина.
Построение калибровочного графика
Способ I – Шелонга—Венде с использованием стабилизирующего свойства белка сыворотки крови. Основной раствор билирубина: в колбе вместимостью 50 мл растворяют 40 мг билирубина в 30–35 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия Na2CO3. Хорошо взбалтывают, не допуская образования пузырьков.
Доводят до 50 мл 0,1 моль/л раствором Nа2СО3 и несколько раз перемешивают. Раствор стоек только в течение 10 мин от начала приготовления. В дальнейшем происходит окисление билирубина.
Рабочий раствор билирубина: к 13,9 мл свежей негемолизированной сыворотки здорового человека добавляют 2 мл свежеприготовленного основного раствора билирубина и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты. Хорошо перемешивают.
При этом выделяются пузырьки углекислого газа. Рабочий раствор стоек в течение нескольких дней.
Этот раствор содержит точно на 100 мг/л, или 171 мкмоль/ л, билирубина больше, чем сыворотка, взятая для приготовления раствора.
Чтобы исключить при Расчетах количество билирубина, содержащегося в этой сыворотке, при измерении на фотометре из величин экстинкции калибровочных проб вычитают величины экстинкции соответствующих разведений компенсационной жидкости.
Для приготовления компенсационной жидкости смешивают 13,9 мл той же сыворотки, которая использовалась для приготовления калибровочного раствора билирубина, 2 мл 0,1 моль/л раствора карбоната натрия и 0,1 мл 4 моль/л раствора уксусной кислоты.
Для построения калибровочного графика готовят ряд разведений с различным содержанием билирубина.
К полученным разведениям прибавляют по 1,75 мл кофеинового реактива и по 0,25 мл диазосмеси. При появлении помутнения можно добавить по 3 капли 30%-ного раствора едкого натра. Измерение проводят при тех же условиях, что и в опытных пробах, через 20 мин.
Из компенсационной жидкости готовят разведения, аналогичные калибровочным (табл. 11), и далее обрабатывают их так же, как калибровочные пробы.
Таблица 11
Определения связанного билирубина
Способ II – калибровочный график строится по готовому набору реактивов «Билирубин-эталон» («Лахема»).
Набор Био-Ла-Тест «Билирубин-эталон» включает:
1) билирубин лиофилизированный (точная концентрация билирубина приведена на этикетке флакона);
2) альбумин лиофилизированный.
Способ приготовления растворов билирубина указан в инструкции к набору.
Калибровочная кривая линейна до 170 мкмоль/л.
Примечание
На правильность метода влияет способ построения калибровочной кривой. Ряд веществ – гидрокортизон, андрогены, эритромицин, глюкокортикоиды, фенобарбитал, аскорбиновая кислота – вызывают интерференцию.
Клинико-диагностическое значение
При печеночных желтухах (гепатиты, циррозы) в крови отмечается резкое увеличение содержания билирубинглюкуронида, происходящее главным образом от разрушения печеночных клеток. Повреждение мембран гепатоцитов приводит к выходу в кровь и прямого, и непрямого билирубина.
Некоторое возрастание количества свободного билирубина наступает вследствие нарушения функции печени (уменьшения активности трансглюкуронидазы и других ферментных систем, участвующих в глюкуронидировании).
Значительное увеличение содержания билирубина сыворотки при механических (застойных) желтухах обусловлено переполнением желчных путей вследствие закупорки, разрыва их и перехода желчи в русло крови.
Обтурационные желтухи сопровождаются резким увеличением прямого билирубина в крови. Длительный застой желчи в печени может вызвать воспалительные изменения в гепатоцитах с последующим увеличением содержания непрямого билирубина сыворотки крови.
Резкое возрастание количества свободного билирубина при гемолитической желтухе происходит в результате гемолиза, приводящего к усиленному образованию непрямого билирубина.
Ряд лекарственных препаратов оказывает влияние на содержание общего билирубина. Они усиливают распад эритроцитов. К ним относятся ацетилсалициловая кислота, тетрациклин, хинин и др.
Могут увеличивать уровень прямого билирубина в плазме препараты, вызывающие задержку желчи в печени: пенициллин, эритромицин, сульфаниламидные препараты, эстрогены, пероральные контрацептивы, андрогены, никотиновая кислота.
Методы исследования показателей липидного обмена
К липидам относятся нейтральные жиры (триглицериды), холестерин (общий, свободный и связанный), фосфолипиды, гликолипиды.
Исследования обмена липидов и липопротеинов (ЛП), холестерина (ХС), в отличие от других диагностических тестов имеют социальное значение, так как требуют неотложных мероприятий по профилактике сердечно-сосудистых заболеваний.
Проблема коронарного атеросклероза показала четкую клиническую значимость каждого биохимического показателя как фактора риска ишемической болезни сердца (ИБС), и в последнее десятилетие изменились подходы к оценке нарушений липидного и липопротеинового обменов.
Риск развития атеросклеротического поражения сосудов оценивают по следующим биохимическим тестам:
1) содержание триацилглицеринов (ТГ) в сыворотке крови;
2) содержание общего холестерина (ОХС) в сыворотке крови;
3) содержание холестерина, входящего в состав липопротеинов высокой плотности (ХС-ЛПВП);
4) содержание холестерина, входящего в состав липопротеинов низкой и очень низкой плотности (ХС-ЛПНП и ХС-ЛПОНП);
5) определение отношений ОХС/ХС-ЛПВП, ХС-ЛПНП/ХС-ЛПВП.
Триглицериды
ТГ – нейтральные нерастворимые липиды, поступающие в плазму из кишечника или из печени.
В тонком кишечнике ТГ синтезируются из экзогенных, т. е. поступивших с пищей жирных кислот, глицерола и моноацилглицеролов. Образованные ТГ первоначально поступают в лимфатические сосуды, затем в виде хиломикронов (ХМ) через грудной лимфатический проток поступают в кровоток. Время жизни ХМ в плазме невелико, они поступают к жировым депо организма.
Наличием ХМ объясняется белесый цвет плазмы после приема жирной пищи. ХМ быстро освобождаются от ТГ при участии липопротеинлипазы (ЛПЛ), оставляя их в жировых тканях. В норме после 12-часового голодания ХМ не определяются в плазме. В связи с низким содержанием белка и высоким количеством ТГ ХМ при всех видах электрофореза остаются на линии старта.
Наряду с поступающими с пищей ТГ в печени из эндогенно синтезированных жирных кислот и трифосфоглицерола, источником которого является обмен углеводов, образуются эндогенные ТГ. Эти ТГ транспортируются кровью к жировым депо организма в составе липопротеинов очень низкой плотности (ЛПОНП). ЛПОНП являются главной транспортной формой эндогенных ТГ. Содержание ЛПОНП в крови коррелирует с подъемом уровня ТГ. При высоком содержании ЛПОНП плазма крови выглядит мутной.
Для исследования ТГ используется сыворотка крови или плазма крови после 12-часового голодания. Хранение образцов возможно в течение 5–7 дней при температуре 4 °С, не допускаются повторное замораживание и оттаивание проб.
Холестерин
ХС является составной частью всех клеток организма. Он входит в состав клеточных мембран, ЛП, является предшественником стероидных гормонов (минерало- и глюкокортикоидов, андрогенов и эстрогенов).
ХС синтезируется во всех клетках организма, однако основная его масса образуется в печени и поступает с пищей. В сутки организм синтезирует до 1 г ХС.
ХС – гидрофобное соединение, основной формой транспорта которого в крови являются белок-липидные мицеллярные комплексы ЛП. Их поверхностный слой образуют гидрофильные головки фосфолипидов, аполипопротеинов. ХС эстерифицированный более гидрофилен, чем ХС, поэтому эфиры ХС с поверхности перемещаются в центр липопротеиновой мицеллы. Основная часть ХС транспортируется кровью в виде ЛПНП от печени к периферическим тканям. Аполипопротеином ЛПНП является апо-В. ЛПНП взаимодействуют с апо-В-рецепторами плазматических мембран клеток, захватываются ими путем эндоцитоза. Освобождающийся в клетках ХС используется для построения мембран и эстерифицируется. ХС с поверхности клеточных мембран вступает в мицеллярный комплекс, состоящий из фосфолипидов, апо-А, и образует ЛПВП. ХС в составе ЛПВП подвергается эстерификации под действием лецитинхолестеролацилтрансферазы (ЛХАТ) и поступает в печень. В печени поступивший в составе ЛПВП ХС подвергается микросомальному гидроксилированию, превращается в желчные кислоты. Выделение его происходит как в составе желчи, так и в виде свободного ХС или его эфиров.
Исследование уровня ХС не дает диагностической информации об определенном заболевании, а характеризует патологию обмена липидов и ЛП. Наиболее высокие цифры ХС имеют место при генетических нарушениях обмена ЛП, таких как семейная гомо- и гетерозиготная гиперхолестеринемия, семейная комбинированная гиперлипидемия, полигенная гиперхолестеринемия. При ряде заболеваний развивается вторичная гиперхолестеринемия: нефротический синдром, сахарный диабет, гипотиреоз, алкоголизм.
Для оценки состояния липидного и ЛП обмена определяют величины ОХС, ТГ, ХС ЛПВП, ХС ЛПОНП, ХС ЛПНП.
Определение этих величин позволяет рассчитать коэффициент атерогенности (Ка):
Ка = ОХС – ХС ЛПВП / ХС ЛПОНП,
а также другие показатели. Для Расчетов необходимо также знание следующих пропорций:
ХС ЛПОНП = ТГ (ммоль/л) / 2,18;
ХС ЛПНП = ОХС – (ХС ЛПВП + ХС ЛПОНП)