Коллектив авторов
Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге
Методы определения содержания триглицеридов
В отечественных лабораториях уровень ТГ чаще всего определяют с помощью химических методов по уровню глицерина, образующегося при гидролизе. Это может приводить к получению завышенных результатов, так как повышение уровня глицерина в крови вызывают некачественное взятие крови (выброс адреналина во время стресса), физические упражнения, состояния, сопровождающиеся метаболическим стрессом.
Наиболее предпочтительными являются ферментные методы исследования содержания ТГ с учетом содержания в холостой пробе свободного глицерина.
Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с ацетилацетоном
Принцип метода
Триглицериды экстрагируются из сыворотки крови. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерин окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся формальдегид образует с ацетилацетоном в слабом уксусном растворе 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию триглицеридов.
Необходимые реактивы
1. Гептан.
2. Изопропиловый спирт (изопропанол).
3. 0,08 н серная кислота (примерно 2,2 мл концентрированной H2SO4 на 1 л воды).
4. Едкий калий, 6,25 моль/л: 17,8 г KOH растворяют в 50 мл, осторожно добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и перемешивая.
5. Уксусная кислота, 50 г/л.
6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO4 × 2H2O (перйодная кислота) в 100 мл 5%-ной уксусной кислоты.
7. Аммония ацетат, 2 моль/л: растворяют 154 г ацетата аммония в воде, объем доводят до 1 л.
8. Ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона (СН3СО СН2СОСН3) разводят раствором уксуснокислого аммония до суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде из темного стекла.
9. Калибровочный раствор триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта. Можно использовать и другие калибровочные растворы, перечисленные в примечании.
Примечание
Если использовать для калибровки раствор триолеина в изопропиловом спирте, то после экстракции и расслоения объем верхней фазы в калибровочных пробах оказывается больше, чем в опытных, что приводит к заниженным результатам анализа. Чтобы избежать этой ошибки, рекомендуют калибровочный раствор готовить по следующей прописи: 510 мг триолеина растворить в 100 мл изопропилового спирта, из полученного исходного калибровочного раствора с содержанием 6 ммоль/л готовить по мере необходимости рабочий калибровочный раствор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 объем исходного калибровочного раствора 4 объемами воды.
Ход определения
К 0,5 мл сыворотки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н серной кислоты, перемешивают и через 5 мин центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н КОН. Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 70 °С. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, после перемешивания снова закрывают пробкой и нагревают еще 10 мин при 70 °С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.
Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды; развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л. Расчет проводят по правилу пропорций или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, уже содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.
Примечание
При отсутствии триолеина или трибутирина для калибровки можно использовать растительное масло, принимая, что образующие его триглицериды имеют ту же молекулярную массу, что и триолеин. Можно проводить калибровку, используя раствор глицерина в этаноле, в этом случае его непосредственно добавляют к щелочному раствору едкого калия.
Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с хромотроповой кислотой
Принцип метода
Триглицериды гидролизуются с освобождением глицерина, который окисляется перйодатом натрия до формальдегида. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие перйодаты восстанавливаются избытком бисульфита натрия, после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хромотроповой кислотой.
Ферментативный метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови
Принцип метода
Триглицериды ферментативно гидролизуются до глицерола в соответствии со следующей схемой реакции:
триглицериды ↔ глицерол + жирные кислоты;
глицерол + АТФ ↔ глицерол-3-Ф + АДФ;
глицерол-3-Ф + О2 ↔ фосфоглицероальдегид + Н2О2;
Н2О2 + 4-аминоантипирин + n-хлорфенол ↔ Н2О2 + хинонимин.
Образующаяся в ходе ферментативной реакции окраска пропорциональна содержанию ТГ. Нормальные возрастные величины триглицеридов:
– до 5 лет – 0,1–1,1 ммоль/л;
– 6–11 лет – 0,36–1,12 ммоль/л;
– 12–15 лет– 0,4–1,56 ммоль/л;
– 16–29 лет – 0,45–1,45 ммоль/л;
– 30–39 лет – 0,43–1,81 ммоль/л;
– 40–49 лет – 0,5–2,1 ммоль/л;
– 50–59 лет – 0,62–2,79 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение
Увеличение концентрации ТГ (гипертриглицеридемия) наблюдается при эссенциальной гиперлипемии и первичной (семейной) гиперлипопротеидемии. Считают, что определение ТГ является одним из решающих показателей для диагностики отдельных типов врожденного нарушения обмена липидов.
К вторичному повышению концентрации триглицеридов приводят ожирение, нарушение толерантности к глюкозе, эрозивные или плоскоклеточные ксантомы, вирусный гепатит, алкоголизм, алкогольный цирроз, билиарный цирроз, внепеченочная обтурация желчных путей, острый и хронический панкреатит, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность, гипертоническая болезнь, острый инфаркт миокарда, хроническая ИБС, тромбоз сосудов мозга, гипотиреоз, сахарный диабет, подагра, беременность, гликогенозы I, III, IV типов, большая талассемия, синдром Дауна, респираторный дистресс-синдром, невротическая анорексия, идиопатическая гиперкальциемия, острая перемежающаяся порфирия, стресс.
Снижение ТГ наблюдается при α-β-липопротеидемии, гиполипопротеидемии, хронических обструктивных заболеваниях легких, инфаркте мозга, гипертиреозе, гиперпаратиреозе, недостаточности питания, синдроме мальабсорбции, лимфангиоэктазии кишечника, поражении паренхимы печени.
Методы определения содержания холестерина сыворотки крови
Методы определения общего холестерина подразделяются на:
1) колориметрические. Насчитывается около 150 колориметрических методов, основывающихся на реакциях образования цветных комплексов;
2) нефелометрические методы, основанные на сравнении степени мутности стандартного и исследуемого растворов;
3) титрометрические методы;
4) флюориметрические методы, позволяющие определять холестерин в микрообъемах сыворотки крови (например, в 0,01 мл ее);
5) газохроматографические и хроматографические методы;
6) гравиметрические методы.
Метод определения общего холестерина в сыворотке крови, основанный на реакции Либермана—Бурхарда (метод Илька)
Принцип метода
В сильнокислой безводной среде ХС взаимодействует со смесью серной, уксусной кислот и уксусного ангидрида. В ходе реакции ХС последовательно окисляется. При этом каждая стадия реакции сопровождается образованием молекулы ХС, которая имеет на одну двойную связь больше, чем соединение, из которого она образовалась. В результате конечного окисления иона получается окрашенное соединение, растворенное в серной кислоте и дающее максимум абсорбции при 410 и 610 нм. Из-за неустойчивости окраски соединения время фотометрирования должно быть точно выдержано.
Реакционная смесь со стандартным раствором ХС имеет изумрудный цвет. Однако пробы сыворотки могут давать зеленый, голубой, бурый цвета. Это связано с тем, что в результате образования эндогенного тепла в реакцию вступают многие компоненты сыворотки крови. Кроме того, в реакции Либермана—Бурхарда свободный ХС и его эфиры образуют цветные комплексы с разным коэффициентом молекулярного поглощения. В случае высокого содержания эфиров ХС оптическая плотность оказывается более высокой. Поскольку на прямое определение ХС влияют многие факторы, реакцию ХС со смесью Либермана—Бурхарда нельзя считать специфичной.
Прямой метод определения ХС относительно прост в исполнении и недорог. Однако токсичность и способность вызывать коррозию системы в современных анализаторах ограничивают применение метода. В крупных лабораториях предпочтение отдают ферментативным методам определения ХС.
Референтные величины: холестерин 4,65–6,46 ммоль/л (180–250 мг/дл).
При концентрации холестерина в пробе выше 16 ммоль/л сыворотку разводят физиологическим раствором в соотношении 1 : 1 (результат).
Реакция чувствительна к изменению температуры, поэтому необходимо особенно соблюдать охлаждение реакционной смеси после добавки серной кислоты.
Билирубин в концентрации выше 50 мкмоль/л влияет на результат анализа. Интерференцию билирубина можно исправить Расчетом. Содержание 17 мкмоль/л билирубина приводит к завышению содержания холестерина в сыворотке примерно на 0,1 моль/л.
Сыворотка должна быть негемолизированной.
Необходимые реактивы
1. Ледяная уксусная кислота.
2. Концентрированная серная кислота.
3. Уксусный ангидрид.
4. Абсолютный этиловый спирт.
5. Кислотная смесь: в сухую колбу наливают 10 мл ледяной уксусной кислоты и 50 мл уксусного ангидрида, затем при постоянном перемешивании и охлаждении добавляют 10 мл концентрированной серной кислоты. Смесь должна быть бесцветной или слегка желтоватой. Хранить в холодильнике в темной склянке с притертой пробкой.
6. Калибровочный раствор: 232 мг холестерина растворяют в 2–3 мл хлороформа и доводят до объема 100 мл абсолютным этиловым спиртом. Приготовленный раствор содержит холестерин в концентрации 6 ммоль/л.
Ход определения
К 2,1 мл кислотной смеси медленно по стенке пробирки добавляют 0,1 мл плазмы или сыворотки без признаков гемолиза, перемешивают встряхиванием и ставят на 20 мин в термостат или на водяную баню при температуре 37 °С, затем фотометрируют в кювете с длиной оптического пути 0,5 см против реактива при длине волны 625 нм.
Построение калибровочной кривой и Расчет: к 0,05–0,2 мл калибровочного раствора добавляют такое количество кислотной смеси, чтобы общий объем был 2,2 мл, перемешивают и выдерживают 20 мин при температуре 37 °С, так же как и опытные пробы, а затем фотометрируют. Окраска калибровочной пробы, в которую взято 0,05 мл калибровочного раствора, соответствует содержанию холестерина в плазме 3 ммоль/л; пробы, в которую взято 0,1 мл, – содержанию 6 ммоль/л и т. д.
Примечания
1. Попадание воды приводит к помутнению раствора.
2. Следы гемолиза или желтушность исследуемой плазмы или сыворотки служат причинами завышенных результатов.
3. Можно использовать для фотометрии и кюветы с длиной оптического пути 1 см, тогда количество кислотной смеси удваивают, а количество исследуемого материала остается прежним.
Метод определения содержания холестерина в сыворотке крови, основанный на холестеролоксидазной реакции
Принцип метода
Холестерин и его эфиры выделяются из липопротеинов детергентами. Холестеринэстераза гидролизует эфиры. В результате последующего ферментативного окисления холестерина холестериноксидазой образуется Н2О2.
Эфир холестерина + Н2О2 ↔ холестерин + жирные кислоты;
холестерин + О2 ↔ холестен-3-ОН + Н2О2;
Н2О2 + n-хлорфенол + 4-аминоантипирин ↔
↔ хинониминовый краситель + Н2О2.
Уровни нормы ХС, выявленные при обследовании «в целом здорового населения», относительно высоки. С точки зрения риска развития ишемической болезни сердца уровни ХС желательны:
1) рекомендуемый – менее 5,18 ммоль/л;
2) умеренный риск – 5,18–6,19 ммоль/л;
3) высокий риск – более 6,22 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение
Увеличение концентрации ХС наблюдается при полигенной гиперлипопротеидемии типа II А и II Б, III, гиперлипопротеидемии I, IV, V типов, вторичной, приобретенной гиперлипопротеидемии, отмечается также при заболеваниях печени, внутри- и внепеченочном холестазе, гломерулонефрите, нефротическом синдроме, ХПН, злокачественных опухолях поджелудочной железы, простаты, гипотиреозе, подагре, ИБС, беременности, диабете, алкоголизме, анальбуминемии, дисглобулинемии, острой перемежающейся порфирии.
Снижение концентрации холестерина обнаружено при дефиците α-липопротеида (болезнь Танжера), гипо- и α-β-липопротеидемии, некрозе печеночных клеток, злокачественных опухолях печени, гипертиреозе, нарушении всасывания, нарушении питания, мегалобластной анемии, сидеробластной анемии, талассемии, острых тяжелых заболеваниях, обширных ожогах, хронических обструктивных заболеваниях легких, умственной отсталости, ревматоидном артрите, лимфангиоэктазии кишечника. Отмечены сезонные колебания уровня ХС: более высокие осенью и зимой, более низкие весной и летом. Повторное определение ХС после инфаркта миокарда необходимо проводить через 3 месяца.
Метод определения содержания липопротеинов высокой плотности в сыворотке крови
Липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и низкой плотности (ЛПНП) в противоположность липопротеинам высокой плотности (ЛПВП) образуют нерастворимые комплексы с гепарином в присутствии ионов марганца. В надосадочной жидкости, оставшейся после осаждения ЛПНП и ЛПОНП, остается α-холестерин или ЛПВП.
Нормальное содержание ХС ЛПВП в сыворотке крови составляет 0,9–1,9 ммоль/л.
Рекомендуются следующие показатели оценки вероятности развития атеросклероза (табл. 12).
Таблица 12
Оценка вероятности развития атеросклероза
Принцип метода
Хиломикроны, ЛПОНП (липопротеины очень низкой плотности) и ЛПНП (липопротеины низкой плотности) осаждаются добавлением фосфорно-вольфрамовой кислоты и хлорида магния.
После центрифугирования супернатант содержит ЛПВП (липопротеины высокой плотности) – фракцию, содержание холестерина в которой определяется ферментативно.
Полученные значения достоверны, если:
1) в пробе нет хиломикронов;
2) концентрация триацилглицеридов не превышает 400 мг/ 100 мл;
3) в пробах не обнаруживается следов III типа дислипопротеинемии.
Таблица 13
Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации
При измерении на Hg 546 нм происходит завышение количества ЛПВП холестерина спектром поглощения гемоглобина, которое можно игнорировать при значениях до 200 мг Нb/100 мл.
Полученный при центрифугировании супернатант должен быть прозрачен. Если проба содержит большое количество триглицеридов (более 1000 мг/100 мл), осаждение липопротеинов может быть неполным (мутный супернатант) или часть осадка может плавать на поверхности. В этих случаях следует развести образец 1 : 1 0,9%-ным раствором NaCl и повторить осаждение.
Клинико-диагностическое значение ХС-ЛПВП
Эпидемиологические исследования показали обратную зависимость между уровнями ХС-ЛПВП и распространенностью ИБС. Определение ХС-ЛПВП способствует выявлению риска развития ИБС. Зависимость нарушения липидного обмена от клинической интерпретации представлена в таблице 14.
Повышению уровня ХС-ЛПВП способствуют такие заболевания, как первичный билиарный цирроз, хронический гепатит, алкоголизм, прочие хронические интоксикации.
Увеличение общих липидов наблюдается через 4 ч после приема пищи.
Основными заболеваниями, сопровождающимися возрастанием общих липидов, являются: ожирение, атеросклероз, сахарный диабет, злоупотребление алкоголем и др.
При ишемической болезни сердца, заболеваниях печени, поражении почек, гипотиреозе, алкоголизме регистрируется повышение общего холестерина.
Уменьшение содержания общего холестерина регистрируется при голодании, злокачественных новообразованиях, заболеваниях органов дыхания, повышенной функции щитовидной железы, анемии, лихорадочных состояниях, обширных ожогах, гнойно-септических заболеваниях и др.
Методы исследования углеводного обмена
Уровень глюкозы в крови, плазме (сыворотке) – лабильный показатель. Он отражает ее содержание в крови только в течение 15 мин. Повторное определение (после 15 мин) может показать другой уровень из-за быстрого изменения ее концентрации. Содержание глюкозы в моче характеризует ее уровень за 4–6 ч, в суточной моче – за 24 ч.
При исследовании глюкозы крови необходимо иметь в виду, что пациент должен перед исследованием голодать не менее 6–8 ч, быть в спокойном состоянии, перед анализом не должен курить, выполнять физическую работу.
Хранение пробы в холодильнике, длительное стояние пробы приводят к заниженным результатам. Несмотря на высокую точность глюкозооксидазного метода определения глюкозы, красители, используемые для измерения продукции перекиси водорода, могут подвергаться окислению и приводить к завышенным результатам.
Определение глюкозы в крови, плазме (сыворотке) и спинномозговой жидкости глюкозооксидазным методом
Принцип метода
Глюкоза в присутствии фермента глюкозооксидазы окисляется кислородом воздуха с образованием в ходе реакции перекиси водорода. Перекись водорода в присутствии фермента пероксидазы окисляет ортотолидин с образованием окрашенного соединения, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию глюкозы.
Нормальное содержание глюкозы – 4,1–5,9 ммоль/л; в возрасте от 60 до 90 лет – 4,6–6,4 ммоль/л; у детей – 3,3–5,6 ммоль/л.
Необходимые реактивы
1. Натрия хлорид, 9 г/л (изотонический раствор): готовят, растворяя 0,9 г NaCl в 100 мл воды.
2. Цинка сульфат, 50 г/л: 5 г сульфата цинка (ZnSО4) растворяют в воде, объем доводят до 100 мл.
3. Натр едкий, 0,3 моль/л: готовят, растворяя 1,2 г NaOH в 100 мл воды, концентрацию проверяют титрованием (она должна быть 0,3 н).
4. Ортотолуидин, 1%-ный раствор: 1 г препарата растворяют в 100 мл абсолютного спирта. Раствор можно хранить в холодильнике в склянке с притертой пробкой несколько месяцев. Имеющийся в продаже препарат можно очистить перекристаллизацией, для чего его растворяют в абсолютном спирте, добавляют воду и выпавшие кристаллы отсасывают на фильтре, затем сушат над хлоридом кальция.
5. Ацетатный буферный раствор рН 4,8: смешивают 4 части 0,25 н уксусной кислоты (проверить титрованием) и 6 частей 0,25 н ацетата натрия (содержит 34 г CH3COONa × 3Н2О в 1 л).
6. Глюкозооксидаза – сухой препарат активностью 3000 ед/мг или больше.
7. Пероксидаза из хрена. Желательно использовать кристаллический препарат фирмы «Реанал» (Венгрия): 1 мг растворяют в 5 мл ацетатного буфера, в холодильнике можно хранить несколько дней.
8. Рабочий реактив: в 80 мл ацетатного буфера растворяют 2 мг глюкозооксидазы и 1 мг пероксидазы, прибавляют 1 мл 1%-ного раствора ортотолуидина, перемешивают и доводят объем буферным раствором до 100 мл. Рабочий реактив должен быть прозрачным, бесцветным или иметь слабо-зеленый оттенок, в этом случае он устойчив при хранении на холоде. Если же окраска интенсивна или через несколько часов после приготовления начинает выпадать осадок, это значит, что ортотолуидин недостаточно чистый и его надо перекристаллизовать.
9. Калибровочные растворы глюкозы. Глюкозу предварительно высушивают при температуре 37 °С и хранят в эксикаторе. Сначала готовят основной раствор с концентрацией 50 ммоль/л, для чего 180 мг вещества растворяют в 20 мл насыщенного раствора (примерно 0,3%-ного) бензойной кислоты. Из этого раствора готовят рабочие калибровочные растворы, содержащие 3; 6; 9; 12; 15; 18 и 21 ммоль/л, для чего берут 0,6; 1,2; 1,8; 2,4; 3; 3,6 и 4,2 мл основного раствора и доводят насыщенным раствором бензойной кислоты до объема 10 мл. Эти растворы содержат глюкозу в тех же концентрациях, в которых она бывает в крови, что облегчает Расчеты при калибровке.
Ход определения
В центрифужные пробирки вносят 1,1 мл раствора хлорида натрия, 0,4 мл раствора сульфата цинка и 0,4 мл 0,3 н раствора NaOH, перемешивают; при этом образуется очень тонкий гель гидрата окиси цинка, в него выпускают 0,1 мл крови или калибровочного раствора, снова перемешивают и через 10 мин центрифугируют при скорости 3000 об./мин в течение 10 мин.
К 1 мл надосадочной жидкости добавляют 3 мл рабочего реактива и осторожно перемешивают. Постепенно начинает развиваться окраска, которая при обычной комнатной температуре достигает максимума через 13–15 мин, а затем постепенно уменьшается. Фотометрируют всегда через один и тот же промежуток времени после добавления рабочего реактива в кюветах с длиной оптического пути 1 см с красным светофильтром (длина волны 625 нм) против холостого опыта, который ставят одновременно с рабочими пробами, но вместо крови берут физиологический раствор хлорида натрия. При приготовлении калибровочного графика вместо проб крови берут 0,1 мл соответствующего калибровочного раствора.
Расчет можно проводить по правилу пропорций или по калибровочному графику, для построения которого на одной оси откладывают концентрацию глюкозы (ммоль/л), а на другой – величину экстинкции.
Примечания
1. Можно сначала выпустить кровь из пипетки в изотонический раствор хлорида натрия, а затем добавить растворы сульфата цинка и NaOH.
2. При систематической работе нет необходимости постоянно строить калибровочный график по всем точкам, достаточно ежедневно обрабатывать холостую пробу и 2–3 точки в диапазоне 3–9 ммоль/л, а полный калибровочный график строить лишь при смене реактивов или налаживании методики.