Коллектив авторов
Анализы. Полный медицинский справочник. Ключевые лабораторные исследования в одной книге

Средства подготовки проб

На качество проводимых в лаборатории исследований существенное влияние оказывает аккуратное и точное выполнение операций дозирования. Основными режимами дозирования являются: прямое дозирование, обратное дозирование, многократное дозирование, разведение. Лабораторные дозирующие устройства подразделяются на пипеточные, клапанные, перистальтические дозаторы. Пипеточные механические дозаторы появились в лабораториях в 1960-е гг. и значительно повысили точность, воспроизводимость дозирования, снизили риск развития профессиональных заболеваний.

Забор дозирующей жидкости проводится в съемный наконечник. Для точности дозирования имеют значение материал, из которого изготовлен наконечник, и его форма. Фирмы-изготовители пипеточных дозаторов не гарантируют высокой точности при применении наконечников, не включенных в соответствующий перечень. Многие пипеточные дозаторы имеют устройства для сброса наконечников.

Пипеточные дозаторы нашли самое широкое применение в работе клинико-диагностических лабораторий.

По способу установки дозы дозаторы делятся на дозаторы с фиксированным объемом дозы, дозаторы с регулируемыми переменными объемами дозы; по количеству каналов дозирования – на одноканальные и многоканальные.

Особые виды дозаторов – специальные устройства, встроенные в автоматические анализаторы и робототехнические разливочные системы или дозирующие автоматы.

В настоящее время все большую популярность обретают электронные, или автоматические, дозаторы. Электронные дозаторы снабжены электронными дисплеями. Отличаются они конструкцией, оформлением, размерами дисплеев, разрешенными объемами пробы и пр. Существуют одно- и многоканальные дозаторы. Электронные дозаторы обладают более высокой точностью, чем механические. Это обеспечивается микропроцессорным управлением, жидкокристаллическим дисплеем, аккумуляторной батареей.

Центрифугирование

Центрифугирование проводит разделение смесей, состоящих из двух или нескольких компонентов с разной удельной плотностью. Разделение частиц с помощью центрифугирования основано на разной скорости осаждения частиц в центробежном поле.

В лабораторной практике чаще всего применяют препаративное центрифугирование, основанное на различиях в скорости седиментации частиц, отличающихся друг от друга плотностью и размерами. Разделяемый материал (в лабораториях это чаще всего кровь) по мере увеличения скорости центробежного ускорения распределяется по плотности и размерам частиц вдоль пробирки. На дно пробирки осаждаются форменные элементы крови, в надосадке – плазма или сыворотка крови. Препаративные центрифуги подразделяются на 3 группы:

1) центрифуги общего назначения;

2) скоростные центрифуги;

3) препаративные центрифуги.

Для разделения крови в лабораториях используют центрифуги общего назначения. Они обеспечивают центрифугирование со скоростью до 8000 об./мин, относительное центробежное ускорение до 6000 g. Отличаются друг от друга емкостью, рядом сменных роторов. Во всех центрифугах данного типа роторы жестко крепятся на валу привода, центрифужные пробирки должны быть вместе с находящимся в них биоматериалом тщательно уравновешены и различаться по весу не более чем на 0,25 г. При неполной загрузке ротора пробирки должны быть размещены симметрично, одна против другой. Таким образом обеспечивается равномерное распределение пробирок относительно оси вращения ротора.

Например, мини-центрифуга СМ-6 со скоростью вращения ротора 1000, 1500, 2750 об./мин рассчитана на 12 пробирок в роторе, применяется для разделения растворов на фракции. Данная центрифуга используется в клинической биохимии, биологии, аналитической химии и т. д.

Мини-центрифуга СМ-70 имеет счетчик определения гематокритного числа. Ее конический ротор рассчитан на 8 капилляров, помещаемых в съемные адаптеры. Система управления обеспечивает поддержание оборотов и автоматическое отключение через заданный интервал времени.

Скоростные центрифуги обладают скоростью до 25 тыс. об./мин. Камера ротора снабжена охлаждающим устройством для предотвращения нагревания, возникающего при его вращении.

Препаративные центрифуги производят центрифугирование со скоростью до 75 тыс. об./мин.

Рефрижераторные центрифуги, центрифуги с нагревательной рубашкой являются центрифугами специального назначения.

Для изучения чистых препаратов макромолекул применяется аналитическое центрифугирование, которое обеспечивает данные о чистоте, молекулярной массе и структуре материала. Аналитические центрифуги развивают скорость до 100 тыс. об./мин.

Термостатирующие и перемешивающие устройства

Термостатирующие и перемешивающие устройства могут иметь разное конструктивное исполнение, могут в качестве блоков входить в общую структуру автоматических анализаторов.

По принципу передачи тепловой энергии термостаты разделяются на жидкостные, суховоздушные и сухие.

В жидкостных термостатах передача тепла к объекту происходит от источника тепла к объекту термостатирования через жидкую среду. В суховоздушных термостатах тепловая энергия передается при участии циркулирующего потока воздуха. В сухих термостатах передача тепловой энергии происходит через металлический блок. Выбор способа термостатирования определяется индивидуально в зависимости от емкости и формы термостатируемого объекта.

Перемешивающие устройства предназначены для перемешивания реакционной смеси с целью ускорения проведения реакции и повышения воспроизводимости результатов. Тип перемешивания и его характеристики зависят от назначения перемешивающего устройства.

В автоматических анализаторах перемешивание обеспечивается струей реагента, впрыскиваемого в кювету.

Методы исследования показателей белкового обмена

При обследовании больных с нарушениями белкового обмена диагностическое значение имеет определение общего белка, альбуминов и белковых фракций. В клинической практике в качестве единого метода определения общего белка принят колориметрический биуретовый метод. Достоинством метода является возможность его использования как при работе в неавтоматизированных лабораториях с отечественными реактивами и реактивами фирмы «Лахема», так и при работе на аналитических системах типа ФП-900 фирмы «Лабсистемс» (Финляндия). В ряде клинико-диагностических лабораторий для оценки состояния белкового обмена применяют простые коллоидные реакции, позволяющие косвенно выявлять изменения в составе белков сыворотки крови. Положительный результат коллоидно-химических проб связан с изменениями соотношения между белковыми фракциями. Чаще всего из флокуляционных проб используют тимоловую пробу.

Также разработаны флюориметрические, поляриграфические методы и атомно-абсорбционная спектрофотометрия. Они характеризуются высокой специфичностью и чувствительностью. Но данные методы в настоящее время в клинической практике широко не используются, поскольку для них требуется специальная аппаратура, высокая квалификация специалиста, и стоимость таких анализов достаточно высока. Данные методы в настоящее время применяются преимущественно в научно-исследовательской практике.

Определение общего белка сыворотки крови биуретовым методом

Принцип метода

Белки сыворотки (плазма) крови, реагируя в щелочной среде с сернокислой медью, образуют соединения, окрашенные в фиолетовый цвет. Эта специфическая биуретовая реакция, характерная для пептидов и белков, применима для фотометрического определения.

В сыворотке здоровых людей содержится 65–78 г/л общего белка, у детей до 6 лет – 5,6–8,5 г/л, у новорожденных – 5,3–8,9 г/л, в моче – 25–70 мг/сутки, в ликворе – 15–45 мг на 100 мл.

Необходимые реактивы

1. Натрия хлорид, 154 ммоль/л (изотонический раствор): 9 г хлорида натрия помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, растворяют в воде и доводят до метки водой.

2. Натр едкий, 0,2 моль/л: 8 г едкого натра помещают в мерную колбу вместимостью 1 л, осторожно растворяют в воде и доводят до метки водой.

3. Калия йодид, 30 ммоль/л (раствор йодида калия в 0,2 моль/л растворе едкого натра): 0,5 г йодида калия помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят 0,2 моль/л раствором едкого натра до метки и растворяют. Реактив стабилен в течение 2 недель при хранении в посуде из темного стекла.

4. Калий-натрий виннокислый 4-водный (сегнетова соль).

5. Меди сульфат 5-водный.

6. Биуретовый реактив: 4,5 г сегнетовой соли растворяют в 40 мл 0,2 моль/л растворе едкого натра, прибавляют 1,5 г сульфата меди и 0,5 г йодида калия и растворяют. Доливают до 100 мл 0,2 моль/л раствором едкого натра. Реактив стабилен при хранении в посуде из темного стекла.

7. Рабочий раствор биуретового реактива: 20 мл биуретового реактива смешивают с 80 мл 0,5%-ного раствора йодида калия. Раствор стабилен.

8. Калибровочный раствор альбумина (из человеческой сыворотки): 100 г/л раствор альбумина в 154 ммоль/л растворе хлорида натрия.

Ход определения

Опытная проба: к 0,1 мл сыворотки прибавляют 5 мл рабочего раствора биуретового реактива и смешивают, избегая образования пены. Через 30 мин (и не позднее чем через 1 ч) измеряют на фотометре в кювете с толщиной слоя 1 см при длине волны 500–560 нм (зеленый светофильтр) против холостой пробы. Холостая проба: к 5 мл рабочего биуретового реактива прибавляют 0,1 мл 154 ммоль/л раствора хлорида натрия, далее обрабатывают как опытную пробу.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора готовят рабочие растворы так, как указано в таблице 7.

Таблица 7

Приготовление калибровочного раствора

Из каждого разведения берут по 0,1 мл рабочего раствора и прибавляют по 5 мл рабочего биуретового реактива; через 30–60 мин измеряют на фотометре, как в опыте против холостой пробы. По полученным данным строят калибровочный график. Калибровочная кривая линейна до 100 г/л альбумина.

Нормальные величины: 65–85 г/л (6,5–8,5 г на 100 мл).

Оценка аналитической надежности метода

Метод специфичен, отличается хорошей воспроизводимостью. Воспроизводимость (V) составляет 1,5–3,5%. На правильность метода влияют качество калибровочного материала и корригирование результатов со значением холостой пробы на реактивы и сыворотку. Небольшое число веществ оказывают интерферирующее действие в данной реакции: билирубин при концентрации больше 85 мкмоль/л, триглицериды – больше 11,4 ммоль/л. Для устранения интерференции, вызванной липидемией (присутствием хиломикронов), применяют экстракцию диэтиловым эфиром. Большинство лекарств не вызывают интерференции.

Клинико-диагностическое значение

Результаты определения общего белка сыворотки крови могут быть ложно завышены при наличии липидемии, желтухи, гемолиза. Продолжительное наложение жгута повышает концентрацию всех белков в пробе.

Пробы, полученные выше места внутривенной инфузии, могут дать ошибочно заниженные результаты из-за локальной гемодилюции.

Увеличение содержания белка более 90 г/л имеет место при гипериммуноглобулинемии, поликлональных или моноклональных гаммопатиях.

Снижение содержания белка ниже 60 г/л в сочетании с потерей белка наблюдается при белоктеряющих гастроэнтеропатиях, острых ожогах, нефротическом синдроме.

Понижение содержания белка, вызванное снижением синтеза белка, наблюдается при белковой недостаточности (тяжелая форма), хронических болезнях печени, синдроме мальабсорбции, нарушениях питания, α-γ-глобулинемии.

Спектрофотометрические методы определения общего белка

Данная группа методов основана на измерении светопоглощения в ультрафиолетовой области. Характерные длины волн для поглощения растворов белка – 200–225 нм (обуславливается пептидными связями) и 270–290 нм (обусловлено присутствием ароматических аминокислот, таких как тирозин, триптофан, фенилаланин в молекуле белка).

Данный метод характеризуется высокой погрешностью и недостаточно высокой эффективностью, поскольку содержание ароматических аминокислот отличается в различных белках сыворотке крови.

Определение белковых фракций сыворотки крови методом электрофореза

При изучении белкового спектра крови в качестве унифицированного метода используется зональный электрофорез с поддерживающей средой-носителем.

Принцип метода

Под влиянием постоянного электрического поля белки сыворотки, имеющие отрицательный заряд, движутся по смоченной буферным раствором бумаге по направлению к положительному электроду со скоростью, зависящей от величины заряда и молекулярной массы частиц. Вследствие этого белки сыворотки крови разделяются на 5 фракций: альбумины, α₁-, α₂-, β-, γ-глобулины.

Альбумины обладают выраженным отрицательным зарядом и небольшой молекулярной массой, поэтому они продвигаются в электрическом поле с наибольшей скоростью и дальше других фракций отстают от линии старта. С меньшей скоростью движутся α₁-, α₂– и β-глобулины.

Наименьшей скоростью продвижения отличаются γ-глобулины, они практически остаются на линии старта. γ-глобулины – крупные белковые молекулы, их заряд близок к нейтральному.

Окрашенные пятна белковых фракций, полученные методом электрофореза на бумаге или других носителях, носят название электрофореграммы.

Измерения и Расчет содержания белковых фракций проводят при денситометрическом сканировании электрофореграмм. Получаемые денситограммы представляют собой графики зависимости оптической плотности и подвижности каждой фракции. Площадь пика пропорциональна количеству белков, находящихся в соответствующей фракции.

Каждая фракция имеет определенный состав белков. Процентное содержание отдельных белковых фракций меняется при многих заболеваниях, хотя общее содержание белка в сыворотке крови может оставаться в пределах нормы (диспротеинемия).

С помощью электрофореза можно провести первый этап оценки следующих патофизиологических процессов: иммунодефицит, активация гуморального звена иммунитета, воспалительный процесс, активация комплемента, снижение синтеза белка, состояние потери белка, внутрисосудистый гемолиз, генетические варианты белков, моно- и поликлональные γ-патии (парапротеинемии).

У здоровых людей содержание альбумина составляет 56,3–68,8%, α₁-глобулинов – 3–5,8%, α₂-глобулинов – 6,9–10,5%, β-глобулинов – 7,3–12,5%, γ-глобулинов – 12,7–19,2%.

Унифицированный метод электрофоретического разделения на пленках из ацетата целлюлозы

Необходимые реактивы

1. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.

2. Лимонная кислота.

3. Барбитал-цитратный (мединал-цитратный) буфер рН 8,6: 7,36 г 5,5-диэтилбарбитурата натрия (мединала), 0,3 г лимонной кислоты растворяют в 700 мл воды в мерной колбе вместимостью 1 л, проверяют рН и доводят водой до метки.

4. Бромфеноловый синий водорастворимый, индикатор.

5. Ртуть двухлористая (сулема, хлорная ртуть).

6. Уксусная кислота ледяная.

7. Пунцовый С.

8. Кислотный красный 2Ж.

9. Трихлоруксусная кислота, раствор 50 г/л.

10. Растворы для окрашивания:

– раствор бромфенолового синего, 0,5 г/л: 10 г двухлористой ртути и 20 мл ледяной уксусной кислоты растворяют в небольшом количестве воды при нагревании на водяной бане, непрерывно помешивая до полного растворения сулемы. Отдельно растворяют 0,5 г бромфенолового синего в воде. Оба раствора помещают в мерную колбу вместимостью 1 л и доводят водой до метки;

– раствор пунцового С: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты;

– раствор кислого красного 2Ж: 0,3 г краски растворяют в 100 мл 50 г/л раствора трихлоруксусной кислоты.

11. Отмывающий раствор – уксусная кислота, 50 г/л раствор.

12. Просветляющие растворы:

– вазелиновое масло;

– смесь: ледяная уксусная кислота и ацетон (1 : 1).

Специальное оборудование

1. Прибор для электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы.

2. Пленка из ацетата целлюлозы.

3. Денситометр.

Ход определения

Подготовка прибора: прежде чем приступить к работе, необходимо ознакомиться с инструкцией по эксплуатации прибора. В соответствии с инструкцией заполняют камеры прибора буферным раствором. Следят, чтобы уровень буфера был одинаковым в обеих камерах.

Подготовка пленок из ацетата целлюлозы: смачивают пленки буферным раствором (помещают в буферный раствор на 5 мин). Удаляют избыток влаги фильтровальной бумагой. Закрепляют пленку матовой стороной кверху (пленки должны располагаться параллельно друг другу и строго параллельно стенкам прибора, не должны провисать). Закрывают камеру крышкой и пропускают ток напряжением 150 В в течение 5 мин, после чего выключают ток.

Нанесение сыворотки: на катодный край пленки наносят 1–4 мкл сыворотки в виде узкой полоски, так чтобы полоски не доходили до края пленки.

Проведение электрофореза: включают ток и проводят электрофоретическое разделение в течение 20 мин при напряжении 150 В и силе тока 1 мА на 1 см поперечного сечения полоски.

Обработка пленок из ацетата целлюлозы: выключают ток, вынимают пленки, высушивают их вначале на воздухе в течение 5–10 мин, затем (для фиксации) в сушильном шкафу при 100 °С в течение 10 мин. Окрашивают в течение 15 мин одним из указанных красителей, после чего пленки несколько раз отмывают от избытка красителя 50 г/л раствором уксусной кислоты до исчезновения фона (3–4 раза). После отмывки пленки промокают фильтровальной бумагой и высушивают на воздухе. Затем пленки просветляют в одном из просветляющих растворов.

Расчет

Измерение проводят на денситометре. Результаты выражают в процентах.

Примечания

1. Можно использовать барбиталовый (мединал-вероналовый) буфер такого же состава, как и для электрофореза на бумаге.

2. После проведения электрофореза буфер из катодной и анодной камер смешивают, что дает возможность использовать его несколько раз.

Электрофоретическое разделение на бумаге

Необходимые реактивы

1. Буфер. Можно использовать различные виды буферов – мединал-вероналовый, боратный, трис-буфер:

– мединал-вероналовый буфер рН 8,6: 10,3 г мединала и 1,84 г веронала растворяют и доводят до 1 л водой;

– трис-буфер рН 8,9: трис-(оксиметил)-аминометан – 60,5 г, этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) – 6 г, борная кислота – 4,6 г, вода – до 1 л.

2. Раствор красителя. Используют различные красители – бромфеноловый синий, амидо черный, азокармин Б и др.: 1 г бромфенолового синего и 20 г двухлористой ртути (сулемы) растворяют в воде, добавляют 40 г ледяной уксусной кислоты и доводят водой до 2 л. Хранят в посуде из темного стекла.

3. Раствор для элюирования – натр едкий, 0,03 моль/л.

Специальное оборудование

1. Прибор для электрофореза на бумаге.

2. Хроматографическая фильтровальная бумага марки «Б» (качество фильтровальной бумаги имеет большое значение: она должна быть однородной и плотной).

Ход определения

Подготовка прибора: в камере необходимо поддерживать определенную влажность воздуха, чтобы предохранить фильтровальную бумагу от высыхания. Для этого прибор закрывают крышкой. Буферный раствор в разных отделах камеры должен иметь одинаковый уровень, чтобы избежать переливания жидкости через ленту.

Подготовка бумаги: полосы фильтровальной бумаги смачивают раствором свежего буфера. Избыток буфера удаляют, отжимая полосы между лентами фильтровальной бумаги, и помещают их в электрофоретическую камеру.

Бумажная лента может быть расположена горизонтально (горизонтальный электрофорез) или под углом (вертикальный электрофорез). При горизонтальном электрофорезе бумажная лента должна быть хорошо натянута.

Нанесение сыворотки: на край ленты наносят по 5–10 мкл негемолизированной сыворотки в виде поперечной полосы, отступив на 0,5 см от краев.

Проведение электрофореза: камеру закрывают крышкой и проводят электрофорез сыворотки в течение 6–24 ч при напряжении от 3 до 8 В на 1 см пути тока. Продолжительность электрофореза устанавливают в зависимости от силы и напряжения тока, вида буферного раствора, рН, длины, ширины и толщины бумажных полос.

Обработка бумажных полос: выключают ток, вынимают ленты, помещают в сушильный шкаф на 10 мин при температуре 105 °С и красят, погружая в раствор красителя на 20 мин. Краситель сливают и ленты несколько раз промывают 20 г/л раствором уксусной кислоты до устранения фона (окрашенные участки бумаги, свободные от белка). Ленты вновь просушивают на воздухе.

Расчет

Измерение проводят на денситометре или на фотометре после элюирования. Результаты выражают в процентах.

Элюирование: кусочки ленты, содержащие отдельные фракции, вырезают и помещают в пробирки для элюирования. Для этого в каждую пробирку с глобулиновой фракцией приливают по 10 мл 0,02 моль/л раствора NaOH, к альбуминовой фракции – 20 мл и оставляют в течение 1–2 ч. Измерение проводят в кювете с толщиной слоя 1 см против 0,02 моль/л раствора NaOH при 500–560 нм (зеленый светофильтр). Величину экстинкции альбуминов умножают на 2. Определяют сумму экстинкции всех фракций, принимая ее за 100%, и вычисляют долю каждой фракции.

Клинико-диагностическое значение

Альбумин является основным онкотическим компонентом плазмы, служит в ней основным резервом азота, его роль в транспорте билирубина, желчных кислот, ионов металлов, лекарств существенно зависит от концентрации.

Абсолютной гиперальбуминемии не существует. Любое состояние, связанное с потерей воды, повышает концентрацию всех белков плазмы, включая альбумин, вызывая относительную гиперальбуминемию.

Снижение содержания альбумина встречается при многих заболеваниях: остром и хроническом воспалении, ревматических болезнях, термических ожогах, грануломатозных процессах, большинстве бактериальных инфекций, вирусных инфекциях с разрушением тканей, некрозах ткани (в частности, при злокачественных процессах), васкулитах, язвенных поражениях кишечника, серозитах, подостром бактериальном эндокардите, некоторых паразитарных поражениях.

Снижение его синтеза в печени обнаруживается при следующих процессах: острые и хронические заболевания печени, амилоидоз, нарушение питания, злокачественные новообразования, застойная сердечная недостаточность, перикардит, поражение клапанов сердца, врожденная анальбуминемия.

Увеличение потери через поверхность тела происходит при нефротическом синдроме, термических ожогах, травмах и раздавливании тканей, транссудации и экссудации из полых органов или эпителиальных поверхностей, после кровотечения и введения кровозамещающих жидкостей, желудочно-кишечных и лимфатических фистулах, повторных торакоцентезах или парацентезах, энтеропатиях, связанных с повышенной чувствительностью к пищевым продуктам (к глютену в злаках).

Повышение катаболизма отмечается при повышенной температуре тела, действии антиметаболитов, некоторых состояниях гиперметаболизма гормонального происхождения (болезнь Кушинга, тиреотоксикоз, преэклампсия).

Повышение объема крови (гиперволемия) характерно для таких состояний, как беременность, введение экзогенных эстрогенов, моноклональные иммунопатии, застойная сердечная недостаточность.

α₁-фракция содержит в основном α₁-антитрипсин, кислый α₁-гликопротеин (орозомукоид), протромбин, тиреоидсвязывающий глобулин. Из перечисленных белков α₁-антитрипсин – белок острой фазы, повышен при многочисленных острых, подострых, хронических воспалительных и неопластических заболеваниях, а также при заболеваниях печени. Снижение содержания имеет место при наследственном дефиците α₁-антитрипсина.

α₂-глобулиновая зона содержит α₂-макроглобулин, гаптоглобин, церулоплазмин, α-липопротеид, эритропоэтин. -Увеличение α₂-фракции имеет место при нефротическом синдроме, некоторых подострых и хронических воспалительных и неопластических заболеваниях, стадиях восстановления после термических ожогов. Снижение содержания α₂-фракции развивается при сахарном диабете, панкреатите, гемолизе.

β-фракция содержит трансферрин, гемопексин, β-липопротеиды. Увеличение содержания β-глобулинов развивается при первичных или вторичных гиперлипопротеинемиях (особенно II типа), моноклональных β-патиях. Снижение содержания белка имеет место при гипо-β-липопротеинемиях, дефиците IgA.

γ-фракция содержит иммуноглобулины G, A, D, М. Наличие на электрофореграммах пиков М-белков во фракциях γ-, β- или α₂-глобулинов требует проведения иммуноэлектрофореза для уточнения характера моноклональных γ-патий.

Увеличение содержания γ-глобулинов встречается при поликлональных γ-патиях – хронических заболеваниях печени, хронических инфекциях, некоторых аутоиммунных заболеваниях; моноклональных γ-патиях – заболеваниях, протекающих с дискразией или лимфопролиферацией клеток лимфоидной ткани (миелома, макроглобулинемия, амилоидоз, лимфома, хроническая лимфоцитарная лейкемия).

Снижение содержания γ-глобулинов встречается при иммунодефицитах или иммуносупрессиях, лимфопролиферативных заболеваниях.

Унифицированный метод проведения тимоловой пробы

Тимоловая проба относится к коллоидно-осадочным, или флокуляционным, реакциям белков плазмы. Флокуляция (осаждение) белков обычно наступает при изменении их заряда, снижении количества воды в сольватной оболочке, увеличении размеров коллоидных частиц.

Принцип метода

Тимоловая проба основана на помутнении смеси при взаимодействии сыворотки с насыщенным раствором тимола в вероналовом буфере (табл. 8).

При взаимодействии тимоло-вероналового буфера с крупнодисперсными белками плазмы (β- и γ-глобулинами) помутнение образует глобулиново-тимол-липидный комплекс.

Необходимые реактивы

1. Тимол, 100 г/л спиртовой раствор: 10 г очищенного тимола растворяют в 96%-ном этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Очистка тимола: 100 г тимола растворяют в 100 мл 96%– ного этилового спирта, фильтруют. К фильтрату прибавляют 1 л холодной воды, сильно встряхивают и оставляют стоять на 20 мин.

Затем фильтруют; кристаллы, оставшиеся на фильтре, промывают 2 раза холодной водой, сушат до постоянной массы вначале на фильтровальной бумаге, затем в течение 2–3 дней в эксикаторе над безводным хлоридом кальция.

2. 5,5-диэтилбарбитуровая кислота (веронал), фарм.

3. 5,5-диэтилбарбитуровой кислоты натриевая соль (мединал), фарм.

4. Буферный раствор: 2,76 г веронала и 2,06 г мединала растворяют и доводят водой до 1 л. Хранят в холодильнике; при появлении осадка раствор не годится к употреблению.

5. Тимолово-вероналовый буфер рН 7,55–7,6: в мерной колбе вместимостью 100 мл смешивают 80 мл буферного раствора и 1 мл 100 г/л спиртового раствора тимола, встряхивают и доливают буферным раствором до метки. Проверяют рН.

6. Бария хлорид.

7. Калибровочный раствор:

– раствор хлорида бария: 1,175 г хлорида бария растворяют и доводят до 100 мл водой;

– серная кислота, 0,1 моль/л.

Суспензия сульфата бария: 3 мл раствора хлорида бария наливают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем до метки 0,1 моль/л раствором серной кислоты, при температуре 10 °С (при этой температуре размеры частиц преципитированного сульфата бария дают относительно стабильный результат). Суспензию сульфата бария готовят перед употреблением.

Ход определения

К 6 мл тимолово-вероналового буферного раствора прибавляют 0,1 мл сыворотки, оставляют стоять 30 мин и затем измеряют оптическую плотность при длине волны 630–690 нм (красный светофильтр) против тимолово-вероналового буфера в кюветах с толщиной слоя в 1 см. Реакцию проводят при комнатной температуре.

Расчет ведут по калибровочному графику.

Построение калибровочного графика: из калибровочного раствора сульфата бария (суспензии) готовят разведения, соответствующие единицам помутнения по Шенк—Хогланд. Калибровочные растворы хорошо встряхивают и тотчас при длине волны 630–690 нм в кюветах с толщиной слоя в 1 см против воды измеряют.

Таблица 8

Тимоловая проба

Примечание

Можно использовать готовый набор реактивов Био-Ла-Тест «Тимоловая проба» («Лахема»), в состав которого входят трис-буфер и малеиновая кислота.

Подобно всем флокуляционным тестам, тимоловая проба является неспецифической реакцией.

Однако она достаточно информативна для оценки функционального состояния печени. Проба положительна в 90–100% случаев при вирусном гепатите уже в преджелтушной стадии, при безжелтушной форме заболевания, а также при токсическом гепатите, постнекротическом циррозе печени, коллагенозах, малярии, вирусных инфекциях. При механической желтухе проба отрицательна.

Норма – 0,4 единицы.

Определение компонентов остаточного азота

Азотистый обмен включает реакции синтеза и распада белков, нуклеиновых кислот, аминокислот, нуклеотидов, а также ряда других азотсодержащих соединений. Для оценки состояния азотистого обмена определяют фракции остаточного азота в сыворотке или в цельной крови. Остаточный азот – это небелковый азот или азот, который остается в центрифугате (фильтрате) сыворотки крови или другой биожидкости после осаждения белков трихлоруксусной, фосфорно-молибденовой или фосфорно-вольфрамовой кислотой. Содержание остаточного азота и его компонентов в сыворотке крови в норме:

1) остаточный азот – 14,3–28,6 ммоль/л;

2) мочевина – 2,50–8,33 ммоль/л;

3) аминоазот (азот аминокислот)– 0,02–0,05 г/л;

4) мочевая кислота М – 0,24–0,50 ммоль/л, Ж – 0,16–0,44 ммоль/л;

5) креатин – 102–408 мкмоль/л;

6) креатинин М – 71–115 мкмоль/л, Ж – 53–97 мкмоль/л;

7) индикан – 0,87–3,13 мкмоль/л;

8) аммиак (цельная кровь) – 17–34 мкмоль/л;

9) ксантопротеиновая реакция – 20 условных единиц.

Увеличение концентрации остаточного азота выше 0,4–0,5 г/л обозначается термином «азотемия». Абсолютная азотемия связана либо с задержкой азотистых шлаков при нарушении функции почек (почечная или ретенционная азотемия) либо с их усиленным образованием (внепочечная или продукционная азотемия). Относительная азотемия наблюдается при дегидратации организма.

Считается, что резкое повышение фракций остаточного азота является плохим прогностическим признаком. Однако следует иметь в виду, что при острых заболеваниях азотемия может носить временный характер.

Основным компонентом фракций остаточного азота является азот мочевины, на долю которого приходится более половины всего остаточного азота.