Аурика Луковкина
Полный курс за 3 дня. Микробиология
2. Строение клеточной стенки и цитоплазматической мембраны
Клеточная стенка – прочное, упругое ригидное образование толщиной 150–200 ангстрем, окружающее протопласт клетки и являющееся одним из основных структурных элементов бактериальной клетки.
Выполняет следующие функции:
1) защитную, осуществление фагоцитоза;
2) регуляцию осмотического давления;
3) рецепторную;
4) принимает участие в процессах питания, деления клетки;
5) антигенную (определяется продукцией эндотоксина – основного соматического антигена бактерий);
6) стабилизирует форму и размер бактерий;
7) обеспечивает систему коммуникаций с внешней средой;
8) косвенно участвует в регуляции роста и деления клетки.
Клеточная стенка при обычных способах окраски не видна, но если клетку поместить в гипертонический раствор (при опыте плазмолиза), то она становится видимой.
Клеточная стенка вплотную примыкает к цитоплазматической мембране у грамположительных бактерий, у грамотрицательных бактерий клеточная стенка отделена от цитоплазматической мембраны периплазматическим пространством.
Клеточная стенка имеет два слоя:
1) наружный – пластичный;
2) внутренний – ригидный, состоящий из муреина.
В зависимости от содержания муреина в клеточной стенке различают грамположительные и грамотрицательные бактерии (по отношению к окраске по Грамму).
У грамположительных бактерий муреиновый слой составляет 80 % от массы клеточной стенки. По Грамму они окрашиваются в синий цвет. У грамотрицательных бактерий муреиновый слой составляет 20 % от массы клеточной стенки, по Грамму они окрашиваются в красный цвет.
У грамположительных бактерий наружный слой клеточной стенки содержит липопротеиды, гликопротеиды, тейхоевые кислоты, у них отсутствует липополисахаридный слой. Клеточная стенка выглядит аморфной, она не структурирована. Поэтому при разрушении муреинового каркаса бактерии полностью теряют клеточную стенку (становятся протопластами), не способны к размножению.
У грамотрицательных бактерий наружный пластический слой четко выражен, содержит липопротеиды, липополисахаридный слой, состоящий из липида А (эндотоксина) и полисахарида (О-антигена). При разрушении грамотрицательных бактерий образуются сферопласты – бактерии с частично сохраненной клеточной стенкой, не способные к размножению.
В зависимости от строения клеточной стенки все бактерии делятся на 4 отдела:
1) грациликуты – бактерии с тонкой клеточной стенкой, грамотрицательные (различные извитые, палочковидные, кокковые формы бактерий, а также риккетсии и хламидии);
2) фирмикуты – бактерии с толстой клеточной стенкой, грамположительные (палочковидные, кокковые формы бактерий, а также коринебактерии и микобактерии, актиномицеты);
3) тенерикуты – бактерии без ригидной клеточной стенки (микоплазмы);
4) мендозикуты – архебактерии с дефектной клеточной стенкой и особенным строением рибосом, мембран и рибосомальных РНК.
К клеточной стенке прилегает цитоплазматическая мембрана толщиной 5–7,5 нм. Она обладает избирательной проницаемостью, принимает участие в транспорте питательных веществ, выведении экзотоксинов, энергетическом обмене клетки, является осмотическим барьером, участвует в регуляции роста и деления, репликации ДНК, является стабилизатором рибосом.
Цитоплазматическая мембрана имеет трехслойную структуру и состоит из двух слоев липидов (25–40 %) со встроенными поверхностными и интегральными белками, пронизывающими структуру мембраны. В ее состав входят фосфолипиды, липопротеин, белки, небольшое количество углеводов и другие соединения. Стоит отметить, что липидный состав мембран непостоянен. Он может меняться в зависимости от условий культивирования и возраста культуры. Разные виды бактерий отличаются друг от друга по липидному составу своих мембран.
Цитоплазматическая мембрана по сути является разделительной перегородкой, через которую с помощью ферментов постоянно осуществляется активный транспорт различных веществ и ионов, являющихся жизненно необходимыми для клетки.
В клеточной мембране содержатся и высокочувствительные рецепторы, дающие возможность клетке идентифицировать сигналы, поступающие из окружающей среды, а также питательные вещества и различные антибактериальные соединения. Кроме того, на поверхности цитоплазматической мембраны находятся активные ферментные системы, которые принимают участие в синтезе белка, токсинов, ферментов, нуклеиновых кислот и других веществ, а также в окислительном фосфорилировании.
В случае избыточного роста относительно роста клеточной стенки цитоплазматическая мембрана образует инвагинаты, или выпячивания, представляющие собой либо сложно закрученные структуры – мезосомы, либо менее сложно закрученные структуры – внутрицитоплазматические мембраны. Хотя роль тех и других в жизнедеятельности клетки до конца не изучена, достоверно известно, что они играют немаловажную роль в образовании клеточных стенок и делении клетки, так как обеспечивают энергией синтез клеточной стенки, а также участвуют в секреции веществ и в спорообразовании, на которые затрачивается большое количество энергии.
3. Дополнительные органеллы бактерий
Дополнительными органеллами бактерий являются жгутики, ворсинки, капсулы и споры.
Жгутики – органеллы движения. Есть у подвижных грамположительных и грамотрицательных бактерий. Это особые белковые выросты, напоминающие собой тонкие спирально закрученные нити, исходящие от цитоплазматической мембраны и прикрепленные к клеточной стенке с помощью базального тела, которое состоит из целой системы дисков, соединяющих цитоплазматическую мембрану и клеточную стенку. Жгутики располагаются на поверхности бактериальной клетки. Длина жгутиков составляет 3–12 мкм, а толщина – 12–20 нм. Количество и расположение жгутиков у разных бактерий неодинаковы. Например, монотрихи имеют лишь один жгутик, а лофотрихи – целый пучок, который располагается на одном полюсе клетки, амфитрихи имеют по одному жгутику на каждом конце, у перитрихов жгутики располагаются по всей поверхности.
Химический состав жгутиков определяется одним веществом – флагеллином – белком, обладающим антигенной специфичностью. Кроме того, жгутики бактерий нередко и сами имеют белковый чехол.
При окраске по Грамму жгутики не видны, поэтому о подвижности бактерий можно судить, рассматривая живые микроорганизмы, приготовленные в виде препаратов «висячая» или «раздавленная» капля, с помощью метода фазово-контрастной микроскопии, либо косвенно – по характеру роста в среде Пешкова (полужидком агаре). При этом неподвижные бактерии растут строго по уколу, а подвижные дают диффузный рост. Бактерии находятся в движении за счет вращательных движений жгутиков. Скорость движения бактерии зависит от особенностей расположения жгутиков и физико-химических свойств среды, при этом большое значение имеют ее вязкость, осмотическое давление и другие показатели. Таким образом, будет совершенно естественным, что бактерии, имеющие жгутики, расположенные термально, будут передвигаться гораздо быстрее, чем бактерии со жгутиками, расположенными по всей поверхности.
Что касается направления передвижения бактерии, то они передвигаются либо беспорядочно, либо путем направленного перемещения большинства клеток таксиса. Кроме ориентированного (таксиса) перемещения, различают хемотаксис, вызванный разницей в концентрации химических веществ в среде, а также аэротаксис, связанный с разницей в содержании кислорода, и фототаксис, при котором различие в освещенности является главным фактором направленного движения.
Ворсинки (пили, фимбрии) – более тонкие и короткие по сравнению со жгутиками полые нитевидные белковые выросты, являющиеся поверхностными придатками бактериальной клетки. Известно более 60 типов ворсинок, хотя наиболее изученными являются только два. В зависимости от типа ворсинок определяется их функция:
1) ворсинки первого типа (комон-пили) покрывают всю поверхность бактерии, которая с их помощью способна прикрепляться к клеткам макроорганизмов. Они характерны для грамположительных бактерий;
2) ворсинки второго типа (половые ворсинки, или секс-пили) участвуют в передаче генетического материала от одной клетки к другой при конъюгации бактерий, обеспечивая контакт между мужскими и женскими бактериальными клетками в процессе конъюгации. Через них идет обмен генетической информацией от донора к реципиенту. Донор – мужская клетка – обладает секс-пилями. Женская клетка – реципиент – не имеет секс-пилей. Белок секс-пили колируется генами F-плазмиды. Также эти ворсинки участвуют и в передаче и распространении лекарственной устойчивости бактерий.
Есть и еще один вид ворсинок, которые несут ответственность за питание и водно-солевой обмен в клетке.
Капсулы – поверхностные структуры большинства бактериальных клеток и представляют собой слизистое образование, которое в зависимости от толщины и строения образует микро– или макрокапсулу, прочно связанную с клеточной стенкой и имеющую четко очерченные внешние границы. Образование капсулы зависит от среды, в которой находится бактерия, она может быть утрачена клеткой с сохранением жизнеспособности. При этом капсулообразование является защитной функцией патогенной бактерии и предохраняет ее от фагоцитоза и других защитных механизмов макроорганизма.
Макрокапсулу можно выявить, используя специальные методы окраски, сочетая позитивные и негативные методы окраски. Как правило, капсула состоит из полисахаридов, реже полипептидов. Поскольку она обладает гидрофильностью, то препятствует фагоцитозу бактерии.
Микрокапсула обнаруживается только при электронной микроскопии и представляет собой утолщение верхних слоев клеточной стенки в виде слизистого образования.
Микрокапсулы характерны для вирулентных бактерий.
Среди бактерий различают:
1) истиннокапсульные бактерии (род Klebsiella) – сохраняют капсулообразование и при росте на питательных средах, а не только в макроорганизме;
2) ложнокапсульные – образуют капсулу только при попадании в макроорганизм.
Капсулы могут быть полисахаридными и белковыми. Они играют роль антигена, могут быть фактором вирулентности.
Внимательно изучая строение клетки, следует отличать слизь, покрывающую клетку, от капсулы. Слизь в отличие от макрокапсулы, как правило, не имеет четких внешних границ и представляет собой мукоидные экзополисахариды, которые участвуют в адгезии, или прилипании к субстратам. Известно, что экзополисахариды синтезируются самими бактериями путем секреции их компонентов или синтезируются при действии внеклеточных ферментов на дисахариды.
Совместными усилиями капсула и слизь играют защитную роль, предохраняя бактерию от повреждений, высыхания (этому способствуют их гидрофильные свойства) и препятствуя действию защитных факторов бактериофагов и макроорганизма.
Споры образуются внутри бактериальной клетки и представляют собой тельца округлой или овальной формы. Факторами образования спор являются обеднение питательной среды, изменение ее влажности и (или) кислотности, а также старение культуры, попадание вегетативных клеток в почву и иное, т. е. возникновение неблагоприятных условий существования для бактерий. Особенности строения и химический состав спор (низкое содержание воды, повышенное количество кальция и др.) обеспечивают им высокую устойчивость к действию физических и химических факторов, что затрудняет борьбу со спороносными патогенными бактериями, способными сохраняться во внешней среде длительное время. Спорообразование присуще грамположительным бактериям. В отличие от вегетативных форм споры более устойчивы к действию химических, термических факторов.
Чаще всего споры образуют бактерии рода Bacillus и Clostridium.
Процесс спорообразования заключается в утолщении всех оболочек клетки. Они пропитываются солями дипикалината кальция, становятся плотными, клетка теряет воду, замедляются все ее пластические процессы. При попадании споры в благоприятные условия она прорастает в вегетативную форму.
У грамотрицательных бактерий также обнаружена способность сохраняться в неблагоприятных условиях в виде некультивируемых форм. При этом нет типичного спорообразования, но в таких клетках замедленны метаболические процессы, невозможно сразу получить рост на питательной среде. Но при попадании в макроорганизм они превращаются в исходные формы.
Тема 3. Физиология бактерий
1. Рост и размножение бактерий
Жизнедеятельность бактерий в основном характеризуется их ростом и размножением.
Рост бактерий – увеличение бактериальной клетки в размерах без увеличения числа особей в популяции. Рост всегда предшествует размножению.
Размножение бактерий – процесс, обеспечивающий увеличение числа особей в популяции. Бактерии характеризуются высокой скоростью размножения, при этом она во многом зависит от видовой принадлежности бактерий и условий выращивания, которые включают в себя характер питательной среды, рН, температуру, аэрацию и др. Бактерии размножаются поперечным бинарным делением, при котором из одной материнской клетки образуются две одинаковые дочерние.
Процесс деления бактериальной клетки начинается с репликации хромосомной ДНК. В точке прикрепления хромосомы к цитоплазматической мембране (точке-репликаторе) действует белок-инициатор, который вызывает разрыв кольца хромосомы, и далее идет деспирализация ее нитей. Нити раскручиваются, и вторая нить прикрепляется к цитоплазматической мембране в точке-прорепликаторе, которая диаметрально противоположна точке-репликатору. За счет ДНК-полимераз по матрице каждой нити достраивается точная ее копия. Удвоение генетического материала – сигнал для удвоения числа органелл. В септальных мезосомах идет построение перегородки, делящей клетку пополам.
Двунитевая ДНК спирализуется, скручивается в кольцо в точке прикрепления к цитоплазматической мембране. Это является сигналом для расхождения клеток по септе. Образуются две дочерние особи.
На плотных питательных средах бактерии образуют скопления клеток – колонии, видимые невооруженным глазом, различные по размерам, форме, поверхности, окраске, зависящей от пигмента бактерий, консистенции и т. д. Наиболее распространенными пигментами среди микроорганизмов являются меланины, каротины, ксантофиллы и другие, многие из которых обладают защитным, антимикробным, антибиотикоподобным эффектом. Вид, форма, цвет, консистенция и другие характерные особенности колоний учитываются при идентификации бактерий и отборе колоний для получения чистой культуры. При этом также следует учитывать, что внешний вид колоний характерен для определенных бактерий, но порой в большей степени зависит от условий культивирования.
На жидких средах рост бактерий характеризуется образованием пленки на поверхности питательной среды, равномерного помутнения или осадка.
Размножение бактерий определяется временем генерации. Это период, в течение которого осуществляется деление клетки. Продолжительность генерации зависит от вида бактерий, возраста, состава питательной среды, температуры и др.
Фазы размножения бактериальной клетки на жидкой питательной среде:
1) начальная стационарная фаза; то количество бактерий, которое попало в питательную среду и в ней находится;
2) лаг-фаза (фаза покоя); продолжительность – 3–4 ч, происходит адаптация бактерий к питательной среде, начинается активный рост клеток, но активного размножения еще нет; в это время увеличивается количество белка, РНК;
3) фаза логарифмического размножения; активно идут процессы размножения клеток в популяции, размножение преобладает над гибелью;
4) максимальная стационарная фаза; бактерии достигают максимальной концентрации, т. е. максимального количества жизнеспособных особей в популяции; количество погибших бактерий равно количеству образующихся; дальнейшего увеличения числа особей не происходит;
5) фаза ускоренной гибели; процессы гибели преобладают над процессом размножения, так как истощаются питательные субстраты в среде. Накапливаются токсические продукты, продукты метаболизма. Этой фазы можно избежать, если использовать метод проточного культивирования: из питательной среды постоянно удаляются продукты метаболизма и восполняются питательные вещества.
Кроме размножения и роста, нормальная жизнедеятельность бактерий характеризуется и возрастной изменчивостью, т. е. способностью к изменению особей в разных стадиях роста, созревания и старения.
2. Питание бактерий
Под питанием понимают процессы поступления и выведения питательных веществ в клетку и из клетки. Питание в первую очередь обеспечивает размножение и метаболизм клетки. Стоит отметить, что бактериальные клетки не имеют специальных органов питания, поэтому являются голофитными.
Среди необходимых питательных веществ выделяют органогены – это девять химических элементов, концентрация которых в бактериальной клетке превосходит 10–4 моль. К ним относят углерод, кислород, водород, азот, фосфор, калий, магний, кальций, сера.
Кроме органогенов, необходимы микроэлементы. Они обеспечивают активность ферментов. Это цинк, марганец, молибден, кобальт, медь, никель, вольфрам, натрий, хлор.
Для бактерий характерно многообразие источников получения питательных веществ.
В зависимости от источника получения углерода бактерии делят на:
1) аутотрофы (используют неорганические вещества – СО2 и не нуждаются в сложных органических соединениях);
2) гетеротрофы (используют в качестве источника углерода разнообразные органические углеродосодержащие соединения, которыми являются углеводы, углеводороды, аминокислоты и органические кислоты);
3) метатрофы (используют органические вещества неживой природы);
4) паратрофы (используют органические вещества живой природы).
Процессы питания должны обеспечивать энергетические потребности бактериальной клетки.
По источникам энергии микроорганизмы делят на:
1) фототрофы (способны использовать солнечную энергию);
2) хемотрофы (получают энергию за счет окислительно-восстановительных реакций);
3) хемолитотрофы (используют неорганические соединения);
4) хемоорганотрофы (используют органические вещества). Факторами роста бактерий являются витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания, присутствие которых ускоряет рост.
Среди бактерий выделяют:
1) прототрофы (способны сами синтезировать необходимые вещества из низкоорганизованных);
2) ауксотрофы (являются мутантами прототрофов, потерявшими гены; ответственны за синтез некоторых веществ – витаминов, аминокислот, поэтому нуждаются в этих веществах в готовом виде).
Микроорганизмы ассимилируют питательные вещества в виде небольших молекул, поэтому белки, полисахариды и другие биополимеры могут служить источниками питания только после расщепления их экзоферментами до более простых соединений.
Метаболиты и ионы поступают в микробную клетку различными путями.
Пути поступления метаболитов и ионов в микробную клетку:
1) пассивный транспорт (без энергетических затрат):
а) простая диффузия;
б) облегченная диффузия (по градиенту концентрации, с помощью белков-переносчиков);
2) активный транспорт (с затратой энергии, против градиента концентрации; при этом происходит взаимодействие субстрата с белком-переносчиком на поверхности цитоплазматической мембраны).
Встречаются модифицированные варианты активного транспорта – перенос химических групп. В роли белков-переносчиков выступают фосфорилированные ферменты, поэтому субстрат переносится в фосфорилированной форме. Такой перенос химической группы называется транслокацией.
3. Метаболизм бактериальной клетки
Обмен веществ (метаболизм) по сути является совокупностью двух взаимосвязанных противоположных процессов – катаболизма (диссимиляции), который представляет собой распад веществ в процессе ферментативных реакций и накопления выделяемой при этом энергии в молекулах АТФ, и анаболизма (ассимиляции), представляющего собой синтез веществ с затратой энергии.
Изучение обмена веществ у бактерий возможно с помощью применения физико-химических и биохимических методов исследования, которые проводятся в ходе культивирования бактерий в определенных условиях на специальных питательных средах, содержащих определенное соединение в качестве субстрата для трансформации.
Особенности метаболизма у бактерий:
1) многообразие используемых субстратов;
2) интенсивность процессов метаболизма;
3) направленность всех процессов метаболизма на обеспечение процессов размножения;
4) преобладание процессов распада над процессами синтеза;
5) наличие экзо– и эндоферментов метаболизма.
В процессе метаболизма выделяют два вида обмена:
1) пластический (конструктивный):
а) анаболизм (с затратами энергии);
б) катаболизм (с выделением энергии);
2) энергетический обмен (протекает в дыхательных мезосомах):
а) дыхание;
б) брожение.
В зависимости от акцептора протонов и электронов среди бактерий различают аэробы, факультативные анаэробы и облигатные анаэробы. Аэробы способны получать энергию только путем дыхания и постоянно нуждаются в молекулярном кислороде как конечном акцепторе электронов. Для них характерно окисление, при котором конечным акцептором электронов является кислород.
Облигатные анаэробы растут только в бескислородной среде или в среде с низким значением редокс-потенциала (Eh). Как тип окислительно-восстановительных процессов для них характерна ферментация с переносом электронов от субстрата-донора к субстрату-акцептору. Из этого можно сделать вывод, что для облигатных анаэробов характерно только брожение, в кислородных условиях наступает гибель микроорганизма из-за образования перекисей, идет отравление клетки.
Факультативные анаэробы способны расти как в присутствии кислорода, так и в его отсутствие, используя при этом в качестве терминальных акцепторов электронов молекулярный кислород или органические соединения. Кроме того, среди факультативных анаэробов встречаются бактерии, способные переключаться с окисления на ферментацию, а также такие бактерии, которые способны расти в присутствии атмосферного кислорода, при этом не используя его, а энергию получают исключительно с помощью брожения.
В микробной клетке ферменты являются биологическими катализаторами, отличающимися от других катализаторов исключительной эффективностью и высокой специфичностью как в отношении природы катализируемой реакции, так и в отношении структуры субстрата. Ферменты обеспечивают протекание реакций в физиологических условиях. Скорость этих реакций зависит от условий, в которых находится данный микроорганизм, в частности от температуры среды, ее рН и других факторов.
По строению среди ферментов выделяют:
1) простые ферменты (белки);
2) сложные; состоят из белковой (активного центра) и небелковой частей; необходимы для активизации ферментов.
Различают также:
1) конституитивные ферменты (синтезируются постоянно независимо от наличия субстрата);
2) индуцибельные ферменты (синтезируются только в присутствии субстрата).
Набор ферментов в клетке строго индивидуален для вида. Способность микроорганизма утилизировать субстраты за счет своего набора ферментов определяет его биохимические свойства.
Ферменты, образуемые микроорганизмами, могут локализоваться в различных частях клетки или быть связанными с ее иными структурами, также могут выделяться в окружающую среду. Поэтому по месту действия ферментов среди них выделяют:
1) экзоферменты – действуют вне клетки; принимают участие в процессе распада крупных молекул, которые не могут проникнуть внутрь бактериальной клетки; характерны для грамположительных бактерий;
2) эндоферменты – действуют в самой клетке, обеспечивают синтез и распад различных веществ.
В зависимости от катализируемых химических реакций все ферменты делят на шесть классов:
1) оксидоредуктазы (катализируют окислительно-восстановительные реакции между двумя субстратами);
2) трансферазы (осуществляют межмолекулярный перенос химических групп);
3) гидролазы (осуществляют гидролитическое расщепление внутримолекулярных связей);
4) лиазы (присоединяют химические группы по двум связям, а также осуществляют обратные реакции);
5) изомеразы (осуществляют процессы изомеризации, обеспечивают внутреннюю конверсию с образованием различных изомеров);
6) лигазы, или синтетазы (соединяют две молекулы, вследствие чего происходит расщепление пирофосфатных связей в молекуле АТФ).
Любой микроорганизм имеет свой ферментный состав, который определяется его геномом и является достаточно постоянным признаком. Поэтому определение ферментов имеет большое значение при дифференцировке и идентификации бактерий. При этом некоторые ферменты могут способствовать проявлению патогенных свойств различными возбудителями инфекционных болезней человека.
